Centro per il sequenziamento del DNA
Dipartimento di Biologia
Università degli Studi di Roma Tor Vergata

Descrizione

Il sequenziatore si avvale di un microcapillare che permette di determinare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA mediante rilevazione della fluorescenza. In sostanza, dopo la migrazione elettroforetica, il campione colpito da una sorgente luminosa (laser ad Argon) emette una fluorescenza che viene rivelata da un sensore (Charge Coupled Device). Il segnale elaborato da un opportuno software mostra in forma grafica a quattro colori la sequenza del DNA in esame. La reazione di sequenza può essere effettuata su DNA a singolo e doppio filamento, su Cosmidi, B.A.C. e frammenti di P.C.R. La marcatura, che avviene nel corso di una P.C.R. lineare, permette di marcare il DNA sia in 5' (utilizzando primer marcati ) sia al 3' (utilizzando terminatori marcati). Il risultato di questa reazione produrrà dei frammenti di DNA, nei quali le differenti basi (G, A, T, C) saranno identificate da quattro diversi colori. Ciascun colorante reagisce alla luce emettendo una propria fluorescenza, ciò permette di correre le quattro reazioni come se fossero un unico campione. La chimica del sistema, molto flessibile, unita al numero di basi lette per ciascuna corsa (da 400 a 600 a seconda del tipo di capillare), hanno consentito di integrare il tradizionale sistema di sequenziamento manuale fino a sostituirlo completamente. Ciò ha comportato un notevole risparmio di tempo ed un abbattimento dei costi d'esecuzione rispetto alla tecnica tradizionale. L'uso dei coloranti fluoresceinati inoltre, sostituendo i tradizionali radionuclidi, ha consentito una diminuzione dell'esposizione a sostanze radioattive. Grazie all'uso razionale dello strumento (corse nell'arco delle 24 ore, week-end compresi) si è ottenuta una notevole riduzione dei tempi morti. Attualmente si può disporre dei dati relativi alla sequenza in un tempo compreso tra una e 24 ore. In alcuni casi è possibile poter disporre della sequenza in tempo reale. Nel corso di questi due anni sono state effettuate circa 6000 sequenze per un totale di 6000 ore lavorative, ciò ha consentito di sequenziare quasi 3.000.000 di basi.